Nature 615권, 925~933페이지(2023)이 기사 인용
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측정항목 세부정보
전체 게놈 배가(WGD)는 인간 암에서 재발하는 현상으로 염색체 불안정성과 이수성 획득을 촉진합니다1,2,3,4,5,6,7,8. 그러나 WGD 세포에서 염색질의 3차원적 구성과 발암성 표현형에 대한 기여는 현재 알려져 있지 않습니다. 여기서 우리는 p53이 결핍된 세포에서 WGD가 염색질 분리(LCS)의 손실을 유도한다는 것을 보여줍니다. 이 현상은 짧은 염색체와 긴 염색체, A와 B 하위 구획, 인접한 염색질 영역 사이의 분리가 감소하는 것이 특징입니다. LCS는 4배체 체크포인트의 활성화를 우회한 세포에서 CTCF 및 H3K9me3의 하향조절에 의해 구동됩니다. 종단 분석에 따르면 LCS는 WGD 세포에서 하위 구획 재배치를 위해 게놈 영역을 프라이밍하는 것으로 나타났습니다. 이로 인해 WGD 세포에서 발생하는 종양의 종양 유전자 활성화와 관련된 염색질 및 후생적 변화가 발생합니다. 특히, 하위 구획 재배치 사건은 염색체 변화와 크게 독립적이었으며, 이는 이것이 종양 발달 및 진행에 기여하는 보완적인 메커니즘임을 나타냅니다. 전반적으로, LCS는 궁극적으로 발암성 후성 유전적 및 전사적 변형을 초래하는 염색질 형태 변화를 시작하는데, 이는 염색질 진화가 WGD 유발 암의 특징임을 시사합니다.
WGD는 세포 내 전체 염색체 세트의 복제로 정의됩니다. 이는 다양한 조직의 초기 및 악성 전 병변에서 관찰되었으며2,9,10 인간 암의 약 30%에서 발생하는 것으로 추정됩니다3. WGD는 종양 형성을 촉진할 수 있는 p53 또는 Rb 결핍 세포3,4와 같은 허용 유전적 배경에서 염색체 변경5,6,7,8을 획득하는 것을 선호합니다1,5. 그러나 단일 핵의 4배체화는 염색질의 3차원(3D) 구조와 후성유전적 특징의 변경을 유도할 가능성이 동일합니다. 간기 동안 염색질은 구획, 염색질 도메인 및 루프11,12,13,14,15,16의 다층 3D 아키텍처로 구성되며 염색질 활동 및 세포 상태와 밀접하게 연관되어 있습니다. 염색질 구조의 변화는 많은 종양 유형에서 보고되었으며 CTCF 또는 코헤신 결합의 변화, 염색체 구조 변형 또는 비정상적인 히스톤 변형으로 인해 발생합니다. 여기서 우리는 WGD를 겪는 세포에서 염색질이 어떻게 구성되는지 조사합니다. 또한 우리는 염색질 구조의 어떤 특징이 WGD에 의해 영향을 받는지, 염색질 조직의 변화가 WGD 이후 세포 표현형에 나타나고 영향을 미치는지 여부를 연구합니다. 마지막으로, 우리는 이러한 변화가 WGD에 의한 종양의 유전적 및 후생적 변화와 상관관계가 있는지 조사합니다.
염색질 조직 및 종양 발달에 대한 WGD의 영향을 이해하기 위해 우리는 세 가지 별개의 세포 모델을 사용했습니다. (1) 변형되지 않은 이배체 세포주 hTERT-RPE1(이하 RPE라고 함); (2) WGD9,26을 통해 식도 선암종이 발생하기 쉬운 전암성 상태인 바렛 식도 환자로부터 유래된 CP-A 세포; 및 (3) 삼배체 K562 세포주에 가까운 백혈병. 인간 종양에서 관찰된 허용 유전적 배경을 모방하기 위해 우리는 p53이 결핍된 CP-A(확장 데이터 그림 1a) 및 RPE 세포(이전에는 RPETP53-/-세포라고 함)를 사용했습니다. K562 세포는 이미 TP53 유전자에 기능 상실 돌연변이를 갖고 있습니다. WGD 세포는 두 개의 독립적인 CP-A TP53-/-클론(클론 3 및 클론 19)과 K562 세포의 유사분열 미끄러짐을 통해 그리고 RPE TP53-/-세포에서 두 가지 별개의 프로토콜을 사용하여 세포질 분열 실패를 통해 얻어졌습니다(그림 1a). WGD가 아닌 염색체 불안정성(CIN)과 관련된 염색질 형태 변화를 제어하기 위해 MPS1 억제제를 사용하여 RPE TP53-/-세포에서 CIN을 유도했습니다(그림 1a). 세포주기 및 핵형 분석을 통해 대부분의 세포에서 처리 후 염색체 수가 두 배가되었고 (그림 1b, c 및 확장 데이터 그림 1b-g) 핵 크기가 증가한 것으로 확인되었습니다 (확장 데이터 그림 1h).
1, adjusted P < 0.01) were enriched in the interferon signalling pathway (Extended Data Fig. 4b), which is consistent with responses to abnormal mitotic segregation and stress31. Conversely, significantly downregulated genes (n = 619, log2(FC) < −1, adjusted P < 0.01) were enriched in the DNA replication, DNA repair and cell cycle pathways (Extended Data Fig. 4c), which is consistent with downregulation of DNA replication proteins in WGD cells7. Changes in expression were not associated with changes in compartment segregation and only moderately with boundary loss of insulation (Extended Data Fig. 4d,e), which indicated that these changes mostly reflected an acute cell response to WGD. In summary, WGD cells, but not CIN-only cells, exhibit LCS manifested in an increased proportion of contacts between long and short chromosomes, distinct chromatin subcompartments, and TADs./p> 0.4), which is a known oncogenic variant37. Nevertheless, this mutation was already present in RPE TP53−/− cells before WGD, and it was not sufficient to induce tumorigenesis in mice (Fig. 4c). Conversely, mutations that were acquired post-WGD did not include known oncogenic variants (Supplementary Table 3)./p> 0.3). These changes comprised upregulation of inducers of cell proliferation and migration such as CDC42, NRAS and JUN (chromosome 1p)42,43, and downregulation of CENPF (chromosome 1q), which is associated with mitotic errors44. NRAS copy number gain was accompanied by an increase in Q61R variant allele frequency (VAFtumour1 = 0.9, VAFtumour2 = 0.75, VAFtumour3 = 0.74), which suggested that the mutated allele was in the amplified haplotype. JUN overexpression was concomitant with an upregulation of components of the AP-1 transcription factor complex (JUND, JUNB, FOS and FOSB) and its downstream targets (Extended Data Fig. 8h). In summary, tumours originated from RPE TP53−/− cells that underwent WGD exhibited hallmarks of WGD-driven human tumours, such as increased CIN and complex rearrangements potentially associated with oncogene activation./p>4N peak) were bulk sorted. Cells were allowed to recover overnight and then fixed for downstream analyses./p>90%). Only Hi-C interactions for which anchors mapped strictly to one of the two haplotypes were retained for analysis, thus obtaining three sets of interaction types: Hap1–Hap1, Hap1–Hap2 and Hap2–Hap2./p>2 for diploid loci) would indicate a nuclei aggregate rather than a single nucleus. Following dispensing, the single nuclei were de-crosslinked by incubation at 65 °C overnight. Next each selected nucleus was mixed with 25 µl Dynabeads MyOne Streptavidin C1 and transferred to a 1.5 ml tube and incubated at room temperature for 1 h on a rotating wheel. The bead-bound fragments were digested with 10 U of AluI restriction enzyme (New England Biolabs, R0137) in 1× rCutSmart buffer (New England Biolabs, B6004) at 37 °C for 2 h. A-tailing reaction and adapter ligation were performed for each single cell as for the bulk Hi-C processing. Similarly, PCR amplification of the single cell libraries was performed in the same master mix as described above for bulk Hi-C, for 27–30 cycles. Libraries were cleaned using AMPure XP beads and then ran on a 2% agarose gel at 100 V for 50–60 min. Successful libraries presented a 300–700 bp smear, which was cut from the gel. DNA purification from the agarose was performed using NucleoSpin Gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel, 740609) following the manufacturer’s instructions. An additional AMPure XP bead size selection was generally necessary to remove any primer dimer contamination. Libraries were sequenced on a NextSeq550 platform (Illumina) in a PE75 configuration./p>= 6, it was kept./p>
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