정상적인 게놈 기능을 위해서는 위상적으로 연관된 도메인 경계가 필요합니다.

커뮤니케이션 생물학 6권, 기사 번호: 435(2023) 이 기사 인용

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측정항목 세부정보

위상학적 연관 도메인(TAD) 경계는 게놈을 별개의 규제 영역으로 분할합니다. 일화적인 증거에 따르면 이들의 파괴가 정상적인 유전자 발현을 방해하고 질병 표현형1,2,3을 유발할 수 있지만 이것이 발생하는 전반적인 정도는 아직 알려지지 않았습니다. 여기에서 우리는 TAD 경계의 표적화된 삭제가 정상적인 생체 내 게놈 기능 및 유기체 발달에 다양한 혼란을 일으킨다는 것을 입증합니다. 우리는 마우스에서 CRISPR 게놈 편집을 사용하여 게놈에서 8개의 TAD 경계(크기 11-80kb)를 개별적으로 삭제했습니다. 조사된 모든 결실은 염색질 상호작용 또는 유전자 발현의 변화, 생존력 감소 및 해부학적 표현형을 포함하는 검출 가능한 분자 또는 유기체 표현형을 초래했습니다. 우리는 TAD의 병합과 삭제된 경계에 인접한 TAD 내의 접촉 주파수 변경을 포함하여 8개 중 7개(88%)의 경우에서 로컬 3D 염색질 구조의 변화를 관찰했습니다. 검사된 유전자좌 8개 중 5개(63%)에 대해 경계 삭제는 배아 치사율 증가 또는 기타 발달 표현형과 관련이 있었습니다. 예를 들어, Smad3/Smad6 근처의 TAD 경계 삭제는 완전한 배아 치사율을 초래한 반면, Tbx5/Lhx5 근처의 삭제는 심각한 폐 기형을 초래했습니다. 우리의 연구 결과는 생체 내 게놈 기능에 대한 TAD 경계 서열의 중요성을 입증하고 임상 유전학 스크리닝에서 TAD 경계에 영향을 미치는 비코딩 결실의 잠재적 병원성을 신중하게 고려해야 할 중요한 필요성을 강화합니다.

진핵생물 게놈은 높은 도메인 내 염색질 접촉 빈도를 특징으로 하는 메가베이스 규모의 염색질 세그먼트인 위상학적 연관 도메인(TAD)으로 접힙니다. TAD는 조절 서열이 상호작용할 수 있는 염색질 주변을 정의하는 동시에 경계를 넘어 조절 상호작용을 절연함으로써 계층적 게놈 구성의 주요 특징을 나타냅니다. TAD 경계는 주로 염색질 구조 분석을 통해 정의되고 측정되며 일반적으로 CCCTC 결합 인자(CTCF), 코헤신 및 콘덴신과 같은 염색체 구조 유지(SMC) 복합체의 구성 요소를 포함한 단백질의 시그니처 세트와 연관되어 있습니다. 및 RNA 폴리머라제 II5,11,12,13,14. TAD는 루프 압출의 결과로 형성되며, 여기서 DNA 가닥은 수렴 방향으로 결합된 CTCF 분자가 만날 때까지 코헤신 또는 SMC 복합체 내에서 미끄러집니다13,15,16,17,18,19. CTCF, 코헤신 또는 코헤신 로딩 인자 Nipbl의 손실은 TAD 중단을 초래하고, 코헤신 방출 인자 Wapl의 손실은 TAD 경계를 강화시킵니다20,21. 흥미롭게도 CTCF22가 손실되면 TAD 경계의 ~20%가 안정적으로 유지됩니다. CTCF 매개 메커니즘과 전사 모두 TAD의 형성과 기능에 영향을 미칠 수 있지만, 둘 다 개별적으로 충분하지도 않고 보편적으로 요구되는 것 같지도 않습니다. 따라서 염색질 상태, 전사 활성 및 TAD 구성은 서로 영향을 미칠 수 있으며 관찰된 포유류 게놈의 핵 구조는 복잡한 상호 작용으로 인해 발생할 수 있습니다.

TAD 경계의 게놈 위치는 포유류 종 전반에 걸쳐 잘 보존되어 있으며, 이는 게놈 내의 기능과 위치가 진화적 제약을 받는다는 것을 나타냅니다5,26,27,28. 이 개념은 일반 인간 집단에서 관찰되는 TAD 경계에서 구조적 변이의 전반적인 고갈에 의해 더욱 뒷받침되는 반면, TAD 구조의 파괴 및 재배열은 유전자의 잘못된 발현에 연루되어 있으며 발달 및 암 표현형과 관련되어 있습니다1,2 3,29,30. 그러나 이러한 중단의 대부분은 조절 요소 및/또는 단백질 코딩 유전자와 같은 이웃 게놈 특징도 포함하는 자발적으로 발생하는 대규모 구조적 돌연변이였습니다. 따라서 이러한 표현형에서 TAD 경계의 구체적인 역할은 잘 알려져 있지 않습니다. 본 연구에서는 생체 내에서 TAD 경계 서열의 기능적 필요성을 조사합니다. 우리는 배아 발생 중에 활성화된 유전자 근처에서 8개의 독립적인 TAD 경계를 선택하고 마우스 게놈에서 이러한 경계를 개별적으로 삭제하고 생존, 게놈 구성, 유전자 발현 및 발달에 대한 결과를 체계적으로 조사했습니다. 8개의 TAD 경계 삭제로 인해 이러한 속성 중 하나 이상이 변경되었습니다. 우리는 또한 더 많은 CTCF 사이트와의 경계 손실이 일반적으로 더 심각한 표현형을 초래하고 가장 심각한 유기체 표현형이 염색질 형태의 뚜렷한 변화와 일치한다는 것을 관찰했습니다. 우리의 결과는 정상적인 게놈 기능과 발달에 TAD 경계 서열이 필요하다는 것을 나타냅니다.

3300 previously annotated TAD boundaries5,10, we scored and prioritized each boundary based on the following criteria: (1) CTCF occupancy aggregated from 62 published CTCF ChIP-seq datasets, which served as a proxy for the expected overall strength of insulation (datasets listed in Supplementary Data 1); (2) co-occupancy of subunits of the cohesin complex and the transcription factor Znf14331 from 38 published ChIP-seq datasets (Supplementary Data 1); (3) CTCF-binding conservation at orthologous regions in four different mammalian species32 (Supplementary Data 2); and (4) whether both flanking TADs contain genes with known roles in embryonic development, preferentially showing divergent patterns of tissue-specific expression (Fig. 1, Supplementary Fig. 1, Supplementary Data 1–3, “Methods”). TAD boundaries that encompassed protein-coding genes were excluded. Following genome-wide prioritization, we selected and deleted 8 individual TAD boundaries from the mouse genome through pronuclear injection of fertilized eggs using CRISPR/Cas9. For all deletions, the outer borders of the boundaries were defined by canonical criteria including the presence of CTCFs and cohesin complex proteins, which are the hallmark of TAD boundaries that are conserved across cell types in closely related species (refs. 13,15,16,17,18,19; see “Methods” for details). These deletions ranged in size from 11 to 80 kb and removed all known CTCF and cohesin binding sites in each TAD boundary region, while leaving any nearby protein-coding genes intact (Fig. 1, Supplementary Fig. 1, Supplementary Data 3, “Methods”). For all eight boundaries, live founder mice heterozygous for the targeted deletion were successfully obtained and bred into stable lines to assess molecular and organismal phenotypes./p>

6000 data points across 350 total measurements; Fig. 4a, Supplementary Fig. 10 and Supplementary Data 7). These systematic phenotyping efforts identified 30 additional parameters with individually significant deviations from wild-type controls (Supplementary Data 7). However, due to the limited sample size and the large number of parameters assessed, these initial observations are generally not significant after correction for multiple hypothesis testing. Nevertheless, in conjunction with the independently observed viability, chromatin, and expression phenotypes in these lines, these data provide leads for further in-depth characterization./p>

0.05; Fig. 3 and Supplementary Fig. 4. Interaction frequencies between genomic loci were additionally visualized on Juicebox (Supplementary Fig. 4)53,54./p>